將待檢測的樣品,準確稱取0.5克,量取99.5mL無菌生理鹽水稀釋,(此次稀釋了200倍,即0.5克樣品,稀釋到了100克水溶液),再加入滅菌玻璃珠20~30粒,于250mL三角瓶中,置于振蕩器或搖床上劇烈搖晃30分鐘以上,目的是將粘連在一起的乳酸菌細胞打散,分散開來。
根據所待檢測的樣品可能的乳酸菌含量,進行適當的稀釋操作,例如如果估計樣品的含乳酸菌活菌數為200億/克左右,則建議稀釋2億倍,這樣將來在90mm平板上培養時,會長出大約100個乳酸菌落,比較便于計數,總之,控制平板培養皿上的乳酸菌落數量在30~300個的范圍內,比較便于計數。
我公司“強微”牌乳酸糞腸球菌系列產品,含乳酸菌活菌數的分析保證值均在100~300億/克范圍內(剛出廠的則在240--720億/克以上),所以,建議稀釋2--3億倍以上即可。
即事先配制好,并滅菌處理的檢測用瓊脂培養基,在水浴鍋內保持50℃的溫度,使瓊脂培養基呈溶解狀態,置于操作臺旁邊備用;(養殖戶可先不從壓力鍋中取出,在壓力鍋維持一定的溫度,從而也不會凝固)
在無菌條件下(打開超凈工作臺無菌風,或養殖戶點上酒精燈),將稀釋了2億倍的乳酸菌液,用移液管移取1mL ,于培養皿中,再在此培養皿中倒入前述保持溶解狀態的檢測培養基液15mL左右(倒培養基時,估計能覆蓋滿平皿的液體量即可),然后,蓋好培養皿蓋,輕輕轉動平皿,原地轉幾圈,使培養基液與乳酸菌液混合均勻,等數分鐘后,待培養基凝固后,可移入培養箱中進行培養;
將前面倒制好的平板,倒轉(即蓋子在下面),放于培養箱中,于33℃溫度下,培養2~3天,待培養皿平板中長出比較明顯的,帶有透明圈的菌落時,即可進行計數,得出檢測結果。
用于檢測乳酸菌的培養基配方為:蛋白胨15g,牛肉膏5g,葡萄糖20g,氯化鈉5g,碳酸鈣10g,瓊脂粉10g,水1000ml,115~121℃滅菌20min,滅菌后放置水浴50℃保溫備用。
① 其中瓊脂的用量只有1%,比常規瓊脂培養基的2%用量少了一半,目的是降低瓊脂凝固溫度,為了在倒制平板時,使培養基能在較低的溫度下與熱敏性的乳酸菌混合,并一直呈溶解狀態,混合均勻后,才慢慢凝固;
② 同時,添加了1%的碳酸鈣,由于碳酸鈣難溶于水,所以,加入碳酸鈣后的瓊脂平板培養基為混濁狀態,為的是在將來培養乳酸菌時,乳酸菌在培養過程中產生乳酸,把菌落周圍的難溶性的碳酸鈣溶解,成為可溶性的乳酸鈣,并使菌落周圍的培養基變得透明,在菌落周圍產生透明圈,從而判斷其為乳酸菌。
四、針對正規實驗室的檢測方法
4. 檢測步驟(針對正規實驗室)
4.1 先準備干熱滅菌的物品(針對正規實驗室)
干熱滅菌是指在恒溫干燥滅菌箱中,以140℃以上的干熱空氣,對箱內物品進行消毒滅菌,主要用于玻璃儀器的滅菌處理。
用報紙(最好有牛皮紙)和橡皮筋等包扎好如下物品:“培養皿、1mL移液管”;根據要檢測的樣品的數量,決定包扎的玻璃儀器的數量。包扎效果見圖示。
以及準備好相應數量的250mL三角瓶,一個樣品需要至少4個三角瓶;
將上述三角瓶,以及包扎好的培養皿,移液管等,放入恒溫干燥滅菌箱中,于140℃以上滅菌3小時以上。備用。
4.2 再準備好濕熱滅菌的物品(針對正規實驗室)
濕熱滅菌是指在滅菌鍋內,通過加熱產生飽和壓力水蒸汽,對物品進行滲透滅菌的過程,主要用于配制好的培養基滅菌,無菌水制作等的消毒處理。
① 平板(或叫培養皿)培養基的配制
用于檢測乳酸菌的培養基配方為:蛋白胨15g,牛肉膏5g,葡萄糖20g,氯化鈉5g,碳酸鈣10g,瓊脂粉10g,水1000ml,溶解于250或500mL三角瓶中,再放入滅菌鍋內消毒滅菌處理,115~121℃滅菌20min,滅菌后放置水浴50℃保溫備用。
② 無菌生理鹽水的配制
通常檢測一個樣品,需要用到至少400毫升無菌生理鹽水,據此,計算您的需要量,配制好后,進行滅菌處理。
生理鹽水含氯化鈉0.85%,即稱取0.85克氯化鈉,溶解于100毫升水中即可,然后,放于滅菌鍋內滅菌處理。備用。
4.3 樣品的制備(針對正規實驗室)
4.3.1 乳酸菌懸液的制備
將待檢測的樣品,準確稱取0.5克,量取99.5mL無菌生理鹽水稀釋,(此次稀釋200倍),再加入滅菌玻璃珠20~30粒,于250mL滅菌三角瓶中,在搖床上于180rpm轉速下,搖晃30分鐘以上,目的是將粘連在一起的乳酸菌細胞打散,分散開來。
4.3.2 用生理鹽水稀釋到2億倍
用1mL的移液管,移取1mL 上述菌懸液,移入250mL滅菌三角瓶中,再加入99mL無菌生理鹽水,搖晃均勻,即此次操作稀釋了100倍,前述乳酸菌懸液的制備時,已稀釋了200倍,則一共稀釋了2×104倍;
再用新的移液管和新的250mL滅菌三角瓶,取上述稀釋液,再重復上述操作,再稀釋100倍,則稀釋了2×106倍;
再用新的移液管和新的250mL滅菌三角瓶,取上述稀釋液,再重復上述操作,再稀釋100倍,則稀釋了2×108倍;即2億倍。
4.4 倒制平板,即接種(針對正規實驗室)
倒制平板在超凈工作臺上進行,以保持無菌環境中操作;
把事先配制好,并滅菌處理后的檢測用培養基,在水浴鍋內保持50℃的溫度,置于操作臺旁邊備用;
取事先干熱滅菌處理后的90mm培養皿(也叫平板)若干、1mL移液管若干,置于操作臺上備用;
在無菌條件下(打開超凈工作臺無菌風),將稀釋了2億倍的乳酸菌液,用移液管移取1mL ,于培養皿中,再在此培養皿中倒入前述保持溶解狀態的檢測培養基液15mL左右(倒培養基時,估計能覆蓋滿平皿的液體量即可),然后,蓋好培養皿蓋,輕輕轉動平皿,原地轉幾圈,使培養基液與乳酸菌液混合均勻,等數分鐘后,待培養基凝固后,可移入培養箱中進行培養;
4.5 培養箱中進行培養
將前面倒制好的平板,放于培養箱中,于33℃溫度下,培養2~3天,待培養皿平板中長出比較明顯的,帶有透明圈的菌落時,即可進行計數,得出檢測結果。
4.6 計數
從培養箱中取出培養好的平板,用記號筆為計數工具,在平板的背面進行計數,如室內光線不好,必要時,將培養皿對著燈光進行計數;
在培養好的平板上,凡是帶有透明圈的菌落,才算是乳酸菌菌落,不然,就不是乳酸菌,我們計數,也就是計算這些帶有透明圈的菌落數。
每計數一個菌落,就用記號筆在平板背面相應位置點一下,留下一個記號痕跡,一直將平板上所有的帶有透明圈的菌落全部數完為止。
記錄計數值。
4.7. 結果計算
計算公式:
樣品中含活的乳酸菌數量(億個/克,或億cfu/g)= 計數值×2
五、針對養殖戶或中小飼料廠的簡單檢測方法
5. 檢測步驟(針對養殖戶或中小飼料廠)
養殖戶或中小飼料廠,如果沒有干燥滅菌箱,可以將全部需要滅菌消毒的物品,都用濕熱滅菌法消毒

,即都使用蒸飯用的壓力鍋消毒即可。
注意:壓力鍋消毒時,要事先在壓力鍋內墊上一個鋁墊片,支起一個內膽,在內膽中放置待消毒物品,墊片處放清水作為蒸汽發生用水,具體見圖未:
濕熱滅菌是指在壓力鍋內,通過加熱產生飽和壓力水蒸汽,對物品進行滲透滅菌的過程。
5.1 再準備好壓力鍋中需要滅菌的物品(針對養殖戶或中小飼料廠)
① 平板(或叫培養皿)培養基的配制
用于檢測乳酸菌的培養基配方為:蛋白胨15g,牛肉膏5g,葡萄糖20g,氯化鈉5g,碳酸鈣10g,瓊脂粉10g,水1000ml,溶解于250或500mL三角瓶中,再放入壓力鍋內消毒滅菌處理,上汽后保持滅菌25min,滅菌后備用。
因為倒制平板時,需要溶解狀態的培養基,而養殖戶往往沒有水浴鍋來保持培養基的溫度達到45~50℃,這是個問題,建議養殖戶,在最后來操作這一步,即所有其他的東西都準備好后,最后來滅菌平板培養基,待它冷卻到手感微燙時,直接用來倒制平板。
② 無菌生理鹽水的配制
通常檢測一個樣品,需要用到至少400毫升無菌生理鹽水,據此,計算您的需要量,配制好后,進行滅菌處理。
生理鹽水含氯化鈉0.85%,即稱取0.85克氯化鈉,溶解于100毫升水中即可,然后,放入壓力鍋內消毒滅菌處理,上汽后保持滅菌25min,滅菌后備用。
③ 其他需要壓力鍋滅菌處理的物品
用報紙(最好有牛皮紙)和橡皮筋等包扎好如下物品:“培養皿、1mL移液管”;根據要檢測的樣品的數量,決定包扎的玻璃儀器的數量。包扎效果見圖示。
以及準備好相應數量的250mL三角瓶,一個樣品至少需要4個三角瓶;
將上述三角瓶,以及包扎好的培養皿,移液管等,放入壓力鍋內消毒滅菌處理,上汽后保持滅菌25min,滅菌后備用。
5.2 樣品的制備(針對正規實驗室)
5.2.1 乳酸菌懸液的制備
將待檢測的樣品,準確稱取0.5克,量取99.5mL無菌生理鹽水稀釋,(此次稀釋200倍),再加入滅菌玻璃珠20~30粒,于250mL滅菌三角瓶中,養殖戶沒有搖床,只能辛苦點,用手握好三角瓶,用力搖晃30分鐘以上,目的是將粘連在一起的乳酸菌細胞打散,分散開來。
5.2.2 用生理鹽水稀釋到2億倍
用1mL的移液管,移取1mL 上述菌懸液,移入250mL滅菌三角瓶中,再加入99mL無菌生理鹽水,搖晃均勻,即此次操作稀釋了100倍,前述乳酸菌懸液的制備時,已稀釋了200倍,則一共稀釋了2×104倍;
再用新的移液管和新的250mL滅菌三角瓶,取上述稀釋液,再重復上述操作,再稀釋100倍,則稀釋了2×106倍;
再用新的移液管和新的250mL滅菌三角瓶,取上述稀釋液,再重復上述操作,再稀釋100倍,則稀釋了2×108倍;即2億倍。
5.3 倒制平板,即接種(針對正規實驗室)
養殖戶沒有超凈工作臺,倒制平板在酒精燈的火焰旁邊進行,但必須有一個比較干凈的操作臺,如瓷板操作臺面上操作,以保持無菌環境中操作;
5.3.1 保持平板培養基的溶解狀態
因為倒制平板時,需要溶解狀態的培養基,而養殖戶往往沒有水浴鍋來保持培養基的溫度達到45~50℃,這是個問題,建議養殖戶,在最后來操作這一步,即所有其他的東西都準備好后,最后來滅菌平板培養基,待它冷卻到手感微燙時,直接用來倒制平板。
5.3.2 倒平板操作
取事先干熱滅菌處理后的90mm培養皿(也叫平板)若干、1mL移液管若干,置于操作臺上備用;
在無菌條件下(點上酒精燈,盡量在避風處,空氣干燥清爽的環境中,以及比較干凈的瓷板操作平臺上操作),將稀釋了2億倍的乳酸菌液,用移液管移取1mL ,于培養皿中,再在此培養皿中倒入前述保持溶解狀態的檢測培養基液15mL左右(倒培養基時,估計能覆蓋滿平皿的液體量即可),然后,蓋好培養皿蓋,輕輕轉動平皿,原地轉幾圈,使培養基液與乳酸菌液混合均勻,等數分鐘后,待培養基凝固后,可移入培養箱中進行培養;
注意以上操作,盡量在酒精燈的火焰旁邊操作。
待平板中的培養基,冷卻凝固后,移入培養箱中進行培養。
5.4 進行培養
將前面倒制好的平板,放于培養箱中,于33℃溫度下,培養2~3天,待培養皿平板中長出比較明顯的,帶有透明圈的菌落時,即可進行計數,得出檢測結果。
如果養殖戶沒有培養箱,也可以在仔豬或雛雞保溫箱中進行培養,熱源采用紅外燈熱源,但注意要使用干凈的箱子或容器來培養。
5.5 計數
從培養箱中取出培養好的平板,用記號筆為計數工具,在平板的背面進行計數,如室內光線不好,必要時,將培養皿對著燈光進行計數;
在培養好的平板上,凡是帶有透明圈的菌落,才算是乳酸菌菌落,不然,就不是乳酸菌,我們計數,也就是計算這些帶有透明圈的菌落數。
每計數一個菌落,就用記號筆在平板背面相應位置點一下,留下一個記號痕跡,一直將平板上所有的帶有透明圈的菌落全部數完為止。
記錄計數值。
5.6. 結果計算
計算公式:
樣品中含活的乳酸菌數量(億個/克,或億cfu/g)= 計數值×2
