強微乳酸糞腸球菌對酸堿度的耐受性試驗研究報告
江西農業大學江西省高校動物營養重點實驗室 南昌瞿明仁 330045
宜春強微生物科技有限公司 宜春鐘啟平 336000
筆者注：本試驗是探討強微復合菌中的乳酸菌部分，對酸堿度的耐受性試驗，是強微公司與江西農大協同創新產學研合作項目之一。
摘要：隨著國家對動物飼料中添加藥的規范，以及烈性傳染性疾病的減少，飼料中添加藥物越來越少，為微生態制劑的應用提供了應用前景。為此，本文對宜春強微生物科技有限公司生產的乳酸糞腸球菌對常見抗生素、不同pH值、牛瘤胃液、人工胃液、人工腸液及膽鹽的耐受性，以及對大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌的抑制作用進行了研究。
乳酸糞腸球菌是一種微生態制劑，主要成分是可與動物共生的有益微生物群，對于改善動物胃腸功能，促進生長和提高生產性能具有明顯的功能。在生產實踐中使用普遍或濫用抗生素及獸藥，耐藥性問題、獸藥殘留問題直接影響著我國動物性食品的質量，也影響了生微生態制劑在生產中的應用。因此國家對動物飼料中添加藥的控制也越來越嚴格，因此，研究、開發及應用新型微生態制劑是今后發展的方向，為此，筆者對宜春強微生物科技有限公司生產的乳酸糞腸球菌進行了對常見抗生素、不同pH值、牛瘤胃液、人工胃液、人工腸液及膽鹽的耐受性，以及對大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌的抑制作用研究，預期為微生態制劑在飼料中應用提供理論基礎。
其中在不同pH環境中耐受性試驗表明，該乳酸糞腸球菌對酸性環境相對耐受性較強，但在長時間作用下，存活率較低，在堿性條件下也有較好的存活率，表明該乳酸糞腸球菌可以在PH2～10的范圍內存在活性，其中PH=2時，處理30分鐘存活率達93.38%，處理120分鐘時達59.93%，PH=10時，處理30分鐘存活率達57.84%，而處理120分鐘時達33.66%，考慮到乳酸菌的脆弱性，試驗表明強微乳酸糞腸球菌對PH的適應范圍達2-10，生存能力在乳酸菌中是非常強的。
本文為乳酸糞腸球菌酸堿度的耐受性試驗結果
1. 材料與方法
1.1、材料
1.1.1、藥物及主要試劑：無菌生理鹽水、1mol/L NaOH溶液由實驗室自行配制；鹽酸、胃蛋白酶、胰蛋白酶購自長城生物公司。
1.1.2、培養基：LB培養基、HM（Mueller-Hinton）培養基，購自長城生物公司。
1.1.3、參照菌株：乳酸糞腸球菌標準菌株ATCC 29212；質控菌株：金黃色葡萄球菌ATCC 25923，購自南昌市長城生物有限公司。
1.1.4、試驗對象：乳酸糞腸球菌，由宜春強微生物科技有限公司提供。
1.2、方法：
1.2.1、不同pH值處理對乳酸糞腸球菌存活率的影響試驗
取10g乳酸糞腸球菌分別加入用1mol/L NaOH調整pH=2.0、3.0、4.0、5.0、8.0、9.0、10.0的90mL生理鹽水中，混勻于室溫中分別處理30min、60min、90min、120min。
處理后溶液用無菌生理鹽水做10-1、10-2、10-3……10倍遞度稀釋，在10-5~10-6兩個稀釋度各取0.1mL，加入無菌平皿；同時取未經pH處理的乳酸糞腸球菌也做10倍遞度稀釋，取10-5~10-6兩個稀釋度為對照。將溶化后冷卻至50℃的MH培養基迅速傾注平皿，小心混勻。置37℃恒溫培養24小時，觀察并記數。以上樣品均重復3次以上，以平均數為準。
存活率=處理后活菌數/未處理活菌數×100。
2、結果
2.1、不同pH值處理對乳酸糞腸球菌存活率影響試驗結果
乳酸糞腸球菌在不同pH條件下，具有不同的耐受性，對酸性受性更強，對堿性，尤其是強堿（pH＝10）時，耐受性較差。隨著時間延長，到120min時，耐受性明顯下降。具體見表1、表2、圖1、圖2。
從表1、表2、圖1、圖2可見，不同PH處理30min后，以PH=10影響最大，菌數最低，其它六種PH均相差不大。處理60min后，仍是PH=10時菌數下降最明顯，但其它六種情況也出現分化，PH=2和PH=9兩種情況下降明顯，其它四種PH處理菌數下降相對平緩。處理90min后，前六種PH處理菌數又趨于接近， PH=10處理后菌數也趨平緩。但到120min后，又是一個明顯的下降，但下降幅度不同PH不同，以PH10、PH4、PH5三種PH環境處理菌數最低，而另四種PH環境處理相對好一些�？傊�，該乳酸糞腸球菌在PH=10環境中，生存能力最差，而在其它六種環境中，90min內比較接近�？紤]到乳酸菌本身的脆弱性，本次試驗結果表明，強微乳酸糞腸球菌的耐酸性是極強的，能在極端PH環境中生存。
表1：不同PH值處理后乳酸糞腸球菌計數結果(單位: ×1010 CFU/g)
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處理時間
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30 min
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60 min
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90 min
|
120 min
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pH值
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2.0
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1.34 ± 0.25
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0.91 ± 0.11
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0.89 ± 0.09
|
0.86 ± 0.16
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3.0
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1.31 ± 0.34
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1.20 ± 0.31
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1.08 ± 0.08
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1.00 ± 0.08
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4.0
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1.18 ± 0.17
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1.13 ± 0.37
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0.97 ± 0.11
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0.53 ± 0.04
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5.0
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1.12 ± 0.27
|
0.99 ± 0.09
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0.98 ± 0.06
|
0.63 ± 0.15
|
|
8.0
|
1.27 ± 0.07
|
1.23 ± 0.13
|
1.06 ± 0.52
|
0.88 ± 0.07
|
|
9.0
|
1.33 ± 0.08
|
0.95 ± 0.06
|
0.93 ± 0.02
|
0.85 ± 0.07
|
|
10.0
|
0.83 ± 0.03
|
0.59 ± 0.13
|
0.58 ± 0.01
|
0.48 ± 0.13
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注：未處理乳酸糞腸球菌計數=1.43×1010 CFU/g
表2：不同PH值處理后乳酸糞腸球菌存活率
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處理時間
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30 min
|
60 min
|
90 min
|
120 min
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|
pH值
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2.0
|
(93.38±17.42)%
|
(63.62±7.67)%
|
(62.02±6.27)%
|
(59.93±11.15)%
|
|
3.0
|
(91.08±23.69)%
|
(83.62±21.60)%
|
(75.05±5.57)%
|
(69.69±5.57)%
|
|
4.0
|
(82.02±11.85)%
|
(78.75±25.78)%
|
(67.46±7.67)%
|
(36.72±2.79)%
|
|
5.0
|
(77.91±18.82)%
|
(68.99±6.27)%
|
(68.50±4.18)%
|
(44.13±10.45)%
|
|
8.0
|
(88.71±4.88)%
|
(85.92±9.06)%
|
(73.87±9.06)%
|
(61.53±4.88)%
|
|
9.0
|
(92.89±9.06)%
|
(65.99±4.18)%
|
(64.67±1.39)%
|
((58.89±4.88)%
|
|
10.0
|
(57.84±2.09)%
|
(40.91±4.88)%
|
(40.21±0.70)%
|
(33.66±9.06)%
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圖9：不同pH條件下，乳酸糞腸球菌耐性試驗結果圖
圖10：不同pH條件下，乳酸糞腸球菌的存活率變化圖
3：小結與討論
3.1、乳酸糞腸球菌在不同pH條件下，具有不同的耐受性，沒有明顯的規律�？傮w來看是對酸性受性更強，對堿性，尤其是強堿（pH＝10）時，耐受性較差。
不同PH處理30min后，以PH=10影響最大，乳酸糞腸球菌存活率最低，其它六種PH均相差不大。處理60min后，仍是PH=10時菌數下降最明顯，但其它六種情況也出現分化，PH=2和PH=9兩種情況下降明顯，其它四種PH處理菌數下降相對平緩。處理90min后，前六種PH處理菌數又趨于接近，PH=10處理后菌數也趨平緩。但到120min后，又是一個明顯的下降，但PH不同下降幅度不同，以PH10、PH4、PH5三種PH環境處理乳酸糞腸球菌存活率最低，另四種PH環境處理相對好一些�？傊�，該乳酸糞腸球菌在PH=10環境中，生存耐受能力最差，而在其它六種環境中，90min內比較接近，隨著時間延長，到120min時，耐受性均明顯下降。
考慮到乳酸菌本身的脆弱性，本次試驗結果表明，強微乳酸糞腸球菌的耐酸性是極強的，能在極端PH環境中生存。
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