強微乳酸糞腸球菌對抗生素耐受性試驗研究報告
江西農業大學江西省高校動物營養重點實驗室     南昌 瞿明仁  330045
宜春強微生物科技有限公司      宜春 鐘啟平   336000

     筆者注：本試驗是探討強微復合菌中的乳酸菌部分，對常規抗生素的耐受性試驗，是強微公司與江西農大協同創新產學研合作項目之一。
       摘要：隨著國家對動物飼料中添加藥的規范，以及烈性傳染性疾病的減少，飼料中添加藥物越來越少，為微生態制劑的應用提供了應用前景。為此，本文對宜春強微生物科技有限公司生產的乳酸糞腸球菌對常見抗生素、不同pH值、牛瘤胃液、人工胃液、人工腸液及膽鹽的耐受性，以及對大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌的抑制作用進行了研究。
      結果發現乳酸糞腸球菌對飼料中國家允許添加的7種常規藥物有不同程度的耐受性：其中對阿散酸的耐受性最強、其次為桿菌肽鋅；對金霉素、喹乙醇、硫酸粘桿菌的耐受性均在國家規定添加量以上；但也發現對吉他霉素、鹽霉素的耐性較差。試驗還表明該乳酸糞腸球菌對大腸桿菌有較強的抑菌作用。
      乳酸糞腸球菌是一種微生態制劑，主要成分是可與動物共生的有益微生物群，對于改善動物胃腸功能，促進生長和提高生產性能具有明顯的功能。在生產實踐中使用普遍或濫用抗生素及獸藥，耐藥性問題、獸藥殘留問題直接影響著我國動物性食品的質量，也影響了生微生態制劑在生產中的應用。因此國家對動物飼料中添加藥的控制也越來越嚴格，因此，研究、開發及應用新型微生態制劑是今后發展的方向，為此，筆者對宜春強微生物科技有限公司生產的乳酸糞腸球菌進行了對常見抗生素、不同pH值、牛瘤胃液、人工胃液、人工腸液及膽鹽的耐受性，以及對大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌的抑制作用研究，預期為微生態制劑在飼料中應用提供理論基礎。
      本文為抗生素耐受性試驗結果

1. 材料與方法
1.1、材料
1.1.1、藥物及主要試劑：15%金霉素、15%桿菌肽鋅、99%阿散酸、98%喹乙醇、10%硫酸粘桿菌素、50%吉他霉素、12%鹽霉素，由江西省某飼料公司技術部惠贈。無菌生理鹽水、1mol/L NaOH溶液由實驗室自行配制；
1.1.2、培養基：
      LB培養基、HM（Mueller-Hinton）培養基，購自長城生物公司。
1.1.3、參照菌株：
      乳酸糞腸球菌標準菌株ATCC 29212；質控菌株：金黃色葡萄球菌ATCC 25923，購自南昌市長城生物有限公司。受試菌株：大腸桿菌K88菌株、金黃色葡萄球菌購自南昌市長城生物公司；雞白痢沙門氏菌，由江西農業大學預防獸醫學教研組保存。
1.1.4、試驗對象：
      強微乳酸糞腸球菌，由宜春強微生物科技有限公司提供。

1.2、方法：
1.2.1、乳酸糞腸球菌對抗生素的耐受性試驗
      本試驗嚴格根據美國臨床試驗室標準委員會(NCCLS)推薦的瓊脂稀釋法測定7種抗菌藥對乳酸糞腸球菌的最低抑菌濃度(MIC)和最高耐藥濃度。
1.2.1.1、抗生素溶液的準備
      按《全國臨床檢驗操作規程》將7種抗菌藥物分別用相應試劑溶解后，用滅菌雙蒸水稀釋成5,120μg/mL的儲存液，-80℃保存備用。試驗時用滅菌雙蒸水稀釋至所需濃度。使用時再稀釋成各種所需要的濃度。具體見表1。

表1：抗菌藥物濃度稀釋的配制方案 

1.2.1.2、菌液的準備與接種
      將送檢乳酸糞腸球菌，接種于MH固體培養基，置37℃培養18-24小時，再分離純化乳酸糞腸球菌為試驗菌種。（編者注：由于本試驗采用了將送檢樣品中的乳酸糞腸球菌分離純化后，再進行耐抗生素試驗，所以，還沒有完全反映出強微乳酸糞腸球菌生產工藝中所采取的包埋保護后的耐受抗生素的效果）
      從平板上挑取單個菌落于LB液體培養基中，置37℃ 150rpm搖菌5h左右，并用LB液體培養基稀釋至OD₆₃₀值為0.1(相當于細菌數1~2×10⁸ CFU/mL)備用。
      將抗菌藥儲存液倍比稀釋成12個藥物濃度（含原液13個濃度），將各濃度抗菌藥各取2mL置無菌平皿，迅速加入18mL滅菌并冷卻至約50℃的MH固體培養基混勻，傾注平板。使各平皿中藥物最終濃度倍比稀釋。慶大霉素僅制成濃度為500μg/mL的MH平板。
      再將菌液調整到濃度為l×10⁷ CFU/mL，分別取1μL菌液接種于加好藥物的MH平板上，細菌最終接種量為1×10⁴ CFU/mL，置37℃恒溫需氧環境培養18~24小時。觀察細菌菌落生長情況。

1.2.1.3、藥敏試驗質量控制：
      每批實驗以金黃色葡萄球菌ATCC 25923作常規藥敏的質控菌株，以完全抑制菌落生長的最低藥物濃度為MIC；以乳酸糞腸球菌標準株ATCC 29212作慶大霉素高水平耐藥篩選質控菌株，在含500μg/mL慶大霉素的MH平板上不生長。實驗重復兩次，取兩次結果平均數。質控結果均符合NCCLS2008年頒布的藥物敏感試驗解釋標準。

1.2.2、乳酸糞腸球菌抑菌試驗：采用牛津杯擴散法

1.2.2.1、將試驗菌株大腸桿菌K88菌株、雞白痢沙門氏菌、金黃色葡萄球菌ATCC 25923復蘇，分別接種營養瓊脂培養基37℃培養18-24小時，從平板上挑取單個菌落于LB液體培養基中，置37℃ 150rpm搖菌5h左右，并用LB液體培養基稀釋至OD₆₃₀值為0.1(相當于細菌數1~2×10⁸ CFU/mL)備用。

1.2.2.2、將乳酸糞腸球菌接種于MH固體培養基37℃培養18-24小時，鉤菌于無菌蒸餾水，稀釋到2×10⁹ CFU/mL為乳酸糞腸球菌實驗用。

1.2.2.3、傾注營養瓊脂培養基于平皿，每平皿藥20mL培養基；冷卻后置37℃恒溫箱保溫24h，以無任何微生物生長為合格培養基。將平皿正面朝上，置一水平桌面，迅速將滅菌牛津杯小心置于瓊脂培養基，輕按，小心加入菌生素（2×10⁹ CFU/mL），每孔100μL，迅速加蓋。

1.2.2.4、小心將加有牛津杯的平皿置37℃恒溫箱培養24h，觀察牛津杯周圍的抑菌圈，并記錄結果于下表。

2、結果
2.1、乳酸糞腸球菌對抗生素的耐受性試驗結果
      對抗生素耐受性試驗結果表明，該菌對七種抗生素有不同程度的耐受性，其對阿散酸耐受性最強，其次為桿菌肽鋅，以下依次為喹乙醇、金霉素、硫酸粘桿菌素（抗敵素）、鹽霉素，對吉它霉素耐受性最次，但仍然有較好的耐受性表現，具體見表2，圖1~圖7。

表2：乳酸糞腸球菌對七種抗生素的耐受性試驗結果 

圖1：耐金霉素試驗結果

      圖注：培養基中加有不同濃度的藥物，加入相同數量的菌液于培養基表面，37℃恒溫需氧環境培養18~24小時，如有菌落生長，即表示該菌能耐受該濃度的藥物（下同），圖1中第5塊平皿開始有菌落出現，該平皿中金霉素為濃度160ppm，即該菌能耐受160ppm金霉素，而MIC即為320ppm。

圖2：耐桿菌肽鋅試驗結果 

圖3：耐阿散酸試驗結果

圖4：耐喹乙醇試驗結果

圖5：耐硫酸粘桿菌素試驗結果

圖6：耐吉他霉素試驗結果

圖7：耐鹽霉素試驗結果

2.2、乳酸糞腸球菌抑菌試驗結果

     試驗結果乳酸糞腸球菌對三種病原菌均有一定的抑菌能力，且對大腸桿菌有較強的抑制作用（筆者注：這一點在江西省農業科學院的養殖試驗中也得到了體現，排泄的糞便中，添加乳酸糞腸球菌的試驗組的糞便中的大腸桿菌數量比對照組要低85%之多），具體見表3圖8。

表3：乳酸糞腸球菌抑菌試驗結果 

圖8：乳酸糞腸球菌抑菌試驗結果圖

3：小結與討論

3.1、本次試驗結果表明，強微乳酸糞腸球菌對7種藥物有不同程度的耐藥作用，其中對阿散酸效果最好，在最高濃度下均不能抑制乳酸糞腸球菌生長，其可以耐受2560ppm濃度的阿散酸濃度，超出國家規定添加量的200多倍；其次為桿菌肽鋅，耐受濃度為1280ppm；其它如金霉素、喹乙醇、硫酸粘桿菌均在國家規定添加量以上。但對吉他霉素、鹽霉素的耐性相對較差。

3.2、本次試驗了對金黃色葡萄球菌、沙門氏菌和K88大腸桿菌的抑菌試驗，試驗結果乳酸糞腸球菌對三種病原菌均有一定的抑菌能力，且對大腸桿菌有較強的抑制作用